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CRISPR-Cas9 系統的應用——基因治療和免疫治療

基因治療指的是通過外源導入的方法,對靶細胞中需要治療和編輯的DNA進行靶向改造,達到治療基因缺陷等疾病的目的。廣義地說,就是對DNA水平的操作治療,那么,從從更小范圍來講,就是將外源基因通過基因轉移技術將其插入病人的適當的受體細胞中,使外源基因導致的某種結果能治療某種疾病,當然就操作策略講有破壞致病基因的表達或者修復原來有缺陷的基因等等手段。
那么,免疫治療呢,講的是對有機體自身免疫不能完成的任務通過其他手段來完成,有一些疾病和病毒能夠逃有機體免疫系統的檢查,從而對有機體造成危害,比如一些腫瘤,艾滋病毒等。CRISPR技術作為最新的一代基因編輯技術,對發展略顯緩慢的幾乎束之高閣的基因治療和免疫治療有了非常大的推動,其靶位點分布密集,較高的編輯效率以及較短的實驗周期,好越來越被證明的安全性都是基因治療和免疫治療中的要害,下面我們簡單看一下基因治療和免疫治療的近期研究案例。

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武漢同濟醫院2016年11月宣布,成功通過基因治療方法修復了青少年雙盲癥患者的視力,這是一種線粒體遺傳病,或者由于線粒體DNA突變導致。研究團隊用安全病毒載體將正確表達的基因注射到患者眼部,代替不正常功能的基因產物,修復了患者的視力。

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美國斯坦福大學的研究團隊2016年11月在《自然》雜志上報道了CRISPR技術修復人造血干細胞中導致鐮刀型血細胞致病基因的研究,研究者一直致力于基因治療鐮刀形血細胞病,之前的研究中已經嘗試了其他早期的基因編輯工具,花了六年時間,現在用數周的時間已經足矣。

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《細胞 》雜志近期也報道了科學家利用CRISPR/Cas9基因編輯系統,在人體免疫T細胞內對45個與HIV入侵宿主相關的基因進行特殊編輯分析,甄別出了其中某些基因經編輯改造發生突變后,可保護T細胞免受HIV病毒的侵入、整合、轉染的研究報告。這對于令人談虎色變的艾滋病的預防和治愈有重要意義。CRISPR技術相關的研究近年來成井噴趨勢足見其熱度,原因恐怕還是CRISPR技術強大的能力可以延伸到各個領域,讓不同的研究者獲得新的靈感和思路。下面我就為大家帶來三篇近期的CRISPR技術在基因治療和免疫治療方面的科學論文的解讀,分別關于應用CRISPR技術抑制導致艾滋病的HIV病毒和導致乙肝的HBV病毒的研究,以及前面提到過的修復鐮刀形血細胞病的研究。

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現在我們進入第一篇詳解的文獻,關于CRISPR系統在HIV治療中的探索。HIV作為導致艾滋病的病毒對人傷害極大,它能夠攻擊人體免疫系統,把人體免疫系統中最重要的CD4T淋巴細胞作為主要攻擊目標,大量破壞該細胞,使人體喪失免疫功能,人會因為機體抵抗力極度下降會出現多種感染,如帶狀皰疹、口腔霉菌感染、肺結核,特殊病原微生物引起的腸炎、肺炎、腦炎,念珠菌、肺孢子蟲等多種病原體引起的嚴重感染等,后期常常發生惡性腫瘤,并發生長期消耗,以至全身衰竭而死亡。雖然全世界眾多醫學研究人員付出了巨大的努力,但至今尚未研制出根治艾滋病的特效藥物,也還沒有可用于預防的有效疫苗。CRISPR技術的快速發展也體現在HIV的治療研究中,我們第一篇解讀的文獻就是關于CRISPR/Cas9系統應用于人細胞內防御HIV-1型病毒,發表在《自然通訊》雜志上,影響因子11分。在解讀前我先總結一下這篇研究論文的研究策略,以方便下面的講解。這項研究中圍繞HIV病毒的生命周期的不同階段,即整合前和后,以及CRSIPR系統中gRNA序列特異靶位點選擇與組合,不同的抵御策略即短期的瞬時轉化和長期的將CRISPR系統整合在宿主基因組上,三個方面開展試驗。

文獻解讀:CRISPR系統在HIV治療中的應用

HIV-1病毒的生命周期與CRISPR系統防御策略

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HIV-1病毒作為一種慢病毒,其生命周期大致如下,完整的病毒顆粒感染宿主細胞,釋放其單鏈的RNA病毒基因組,單鏈RNA在反轉錄成雙鏈DNA后進入宿主細胞核并整合到宿主基因組上以逃避宿主免疫系統,潛伏下來成為前病毒,再次過程中利用宿主細胞轉錄病毒基因組并表達病毒基因,組裝后釋放。上一頁的研究策略中講到,治療HIV 的兩個階段就是其生命周期中游離的雙鏈DNA時期,以及整合的前病毒時期,原因大家都很了解,CRISRP系統是針對雙鏈DNA作用的。

gRNA設計與預實驗

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7個sgRNA靶位點設計:gEGFP-T1~T4 ; gLTR-T1~T3

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首先需要設計一個預實驗來確認CRISPR/cas9系統是否能識別并造成慢病毒基因組的靶向斷裂,用的病毒模型是不具有復制能力的假型慢病毒。這里gRNA設計針對GFP綠色熒光蛋白的編碼區和,慢病毒LTR序列設計了7個靶點,在靶點選擇上具有兩個不同策略,即在功能蛋白基因的編碼區和具有其他功能的非編碼區設計靶位點。當然,靶位點的選擇需要具有唯一性,不能在宿主基因組和病毒基因組的其他位置具有相同的靶點。第一個實驗設計中先使用密碼子優化過的hCas9和gRNA載體處理HEK293細胞20-24小時,然后用上述的GFP慢病毒載體處理細胞,并觀察4天。流式細胞儀檢測發現空載gRNA對照組和脫靶對照組的的熒光陽性細胞百分數和熒光強度相似,而7個靶向gRNA實驗組則表現為GFP陽性細胞百分數和熒光強度都下降,根據靶位點的不同,熒光強度減少范圍從18%-72%,減少最多的是gEGFP-T1。這里還少不了要做一個對照試驗,即只用CRISPR系統中單一的組分即只有Cas9和只有gRNA的條件下的對比,結果應當是與空載對照組結果相同的。

非整合慢病毒試驗

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上述的實驗可以成為一個預實驗,初步證明在有效gRNA和Cas9同時存在時,可以抑制慢病毒的表達。前面講過,慢病毒DNA基因組在細胞中有兩種狀態,一種是游離的,一種是整合的。第一個試驗中CRISPR系統實在那種狀態下對病毒作用呢?想確定這個問題就需要再設計實驗進行確認。研究者使用了一種非整合型的慢病毒,即這種病毒會在宿主細胞中以游離形式存在,重復第一階段的實驗,看上面兩行和左下的實驗結果圖發現空載gRNA和脫靶gRNA對照組的細胞熒光強度,熒光陽性細胞數都明顯的高于靶向gRNA組。這表明CRISPR系統對于游離的非整合病毒基因組具有很好的抑制作用。當然必要的對照試驗不能少,右下的圖做的是在無其他處理條件下用整合型和非整合型慢病毒處理細胞觀察綠色熒光,7天時整合型慢病毒感染的細胞熒光達到最高并維持,而非整合性慢病毒感染的細胞熒光也在7天左右的時間降到低點并維持,這說明非整合型慢病毒感染一段時間后熒光量下降都是CRISPR系統的作用??赡艿脑蚴怯坞x狀態的慢病毒被宿主細胞識別并降解了。

整合慢病毒試驗

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第二階段的實驗確認了CRISPR系統可以抑制非整合狀態下的慢病毒表達,下一階段的實驗自然是要探究CRISPR系統對整合狀態下慢病毒的作用,這是非常符合科學實驗邏輯的,在講解完這篇文章我們會再回過來說一說科學邏輯的重要性。這一階段的實驗準備了幾個可以耐受不同拷貝數慢病毒整合HEK293細胞系,看中間的圖B,拷貝數從兩個到8個。把CRISPR系統質粒轉入這些細胞中,觀察細胞熒光的情況。結果發現感染細胞的熒光強度逐漸減少到未感染細胞的程度,看左上圖,是轉CRISPR系統后14天后的熒光圖,下層是DAPI染色的??梢钥吹娇瞻讓φ战M和脫靶對照組的熒光非常強烈,而靶向組的熒光已經非常少了,從DAPI染色圖也可以看出,靶向組的無熒光位置是有細胞的,當然這里放的是第一二階段中效果最好的EGFP-T1靶向gRNA的圖。。這里體現了CRISPR系統可以通過破壞前病毒基因組而達到永久抑制的目的,這與RNAi等臨時抑制的策略是完全不同的。測序結果也表明,CRISPR系統對GFP編碼區和LTR區域的靶位點造成了插入或者缺失導致了表型上GFP的表達抑制。右上圖是全長慢病毒PCR擴增情況,可以發現GFP陰性細胞中的全長病毒基因組也減少了。這表明CRISPR系統可以對整合狀態的慢病毒基因組造成插入和缺失的突變,以及全長切除的情況。以gLTR-T2 gRNA組為例,看右下的直方圖,qPCR測定脫靶對照的相對拷貝數最高,而處理組中病毒基因組的相對拷貝數大約下降了40%左右,而進一步測定GFP陰性細胞中的病毒拷貝數比對照組下降了80%左右。

整合慢病毒試驗

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這是在一個月時間范圍內的實驗圖,高低拷貝兩個組都有,可以看到空白對照組和脫靶組的細胞熒光強度一直處在較高水平,而實驗組的熒光水平隨時間都有明顯降低。其中有的實驗組中使用了雙gRNA,這樣的實驗組的熒光強度都處在非常低的水平。從第十八天開始,對gEGFP-T1組的進行二次處理,二次處理中的空白組和脫靶組的熒光水平基本維持了第18天的水平,而其他有效gRNA組的熒光強度進一步下降??偟膩砜?一次處理的第七天左右,所有有效gRNA組的熒光水平已經降到低點,隨后10天基本維持在這個水平,第二次處理后熒光強度進一步下降。這表明可能存在一個長期的-低劑量的組合治療方法,在減少對細胞傷害條件下更有效的破壞前病毒基因組。到這里我們再總結一下,對兩個階段即游離病毒和整合病毒,兩種靶位點選擇即編碼區和非編碼區作用效果都做過了驗證試驗,效果還是比較明顯的。到這里還沒有出現HIV病毒,那下一階段就要對HIV病毒進行實驗。

HIV抗病毒試驗

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構建假型(HIV-1 nl4-3-Δe-GFP)和野生型(HIV-1 nl43-GFP)HIV病毒

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現在HIV病毒正式參與到實驗中來,考慮到病毒載體,野生型病毒和類野生型病毒在感染細胞過程中存在差別,首先測試CRISPR系統是否能破壞一般的病毒基因組。根據前面講到的唯一性的gRNA設計原則,選擇在結構蛋白(gag、env),酶(pol)以及毒性基因(vif and rev),以及LTR區設計了眾多的gRNA靶點。從上方的這個圖中可以看出,構建的兩個病毒基因組,野生型的基因組沒有破壞任何元件,額外插入一個GFP的轉錄單元,假型病毒在結構蛋白ENV編碼區插入了一個GFP的開放閱讀框,并對env造成失活。用靶向gRNA和Cas9處理后發現假型病毒的綠色熒光下降了48%-92%,從下方的圖中也可以看出空白對照和脫靶對照組的熒光量沒有變化。從圖中還可看出,針對LTR區域設計的gRNA導致了更好的抑制效果,尤其是LTR區中的R序列效果最好,在此基礎上除了R序列的gRNA,再加一個其他gRNA進行雙重抑制,效果較單獨的R序列抑制要更好,從右下圖中可以看出,配合另一個LTR區的gRNA效果比編碼區的gRNA更好。

HIV抗病毒試驗

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